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NEUROBIOLOGIA

Respuesta del sistema nervioso central a lesiones traumáticas: papel de las proteínas antioxidantes metalotioneínas

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© Juan Hidalgo , 2004  
Juan.Hidalgo@uab.es

RESUMEN[ABSTRACT]

Lesiones mecánicas del sistema nervioso central (SNC) de un mamífero adulto pueden causar pérdidas funcionales generalizadas que en muchos casos resultan en déficits neurológicos permanentes. La severidad clínica observada es consecuencia de la poca capacidad que tiene el SNC para reconstruirse después de una lesión traumática, en contraposición con la mayoría de tejidos periféricos. Esto es particularmente evidente en lo que a la proliferación neuronal y al restablecimiento de conexiones neuronales se refiere. Sin embargo, en realidad el SNC responde robustamente a una gran variedad de lesiones traumáticas. Las neuronas, las principales células del SNC, pero también las células gliales (fundamentalmente microglia y astrocitos), generan multitud de factores (neurotrofinas, factores de crecimiento, citoquinas, etc.) que forman una compleja red reguladora de la supervivencia neuronal, activación glial y reclutamiento de células inflamatorias, y que intentan frenar las consecuencias de la lesión. Dilucidar las causas por las que, a pesar de estas respuestas, el SNC no consigue restablecer su estructura tras una lesión es de importancia fundamental. Diversas evidencias indican que el estrés oxidativo, un desequilibrio entre la producción de radicales libres del oxígeno y los sistemas antioxidantes de la célula, podría tener una especial relevancia en la patofisiología de las lesiones traumáticas del SNC, y probablemente en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Mi grupo de investigación ha trabajado, entre otros aspectos de la respuesta inflamatoria, en la caracterización del papel de las proteínas antioxidantes metalotioneínas (MT) en la respuesta del SNC frente a diversos modelos de daño cerebral en el ratón.

Metalotioneínas: una superfamilia de proteínas

En 1957, Margoshes y Vallee describían por primera vez una proteína del riñón de caballo que mostraba una alta afinidad por el cadmio, un metal pesado tóxico (Margoshes & Vallee, 1957). Esta proteína fue subsecuentemente caracterizada bioquímicamente por Kägi y Vallee (Kägi & Vallee, 1960; Kägi & Valle, 1961), y en base a su alto contenido metálico y de residuos del aminoácido cisteína (Cys), nombrada metalotioneína (MT). En estas históricas publicaciones se sugirieron funciones fisiológicas tales como el transporte y almacenamiento de metales pesados esenciales (zinc, cobre) y la detoxificación de metales no esenciales (cadmio, mercurio), pero actualmente se considera que otras funciones, como la protección frente al estrés oxidativo, son más probables. Desde el descubrimiento en 1991 de la MT-III como un posible factor inhibidor de la supervivencia neuronal implicado en la etiología de la enfermedad de Alzheimer (Uchida et al., 1991), el interés por estas proteínas ha crecido de manera extraordinaria. En esta revisión comentaré diversos aspectos de estas proteínas en cuanto a su papel en el sistema nervioso central (SNC). Para una discusión más general de estas proteínas, consúltese libros y revisiones como los siguientes (Kägi & Nordberg, 1979; Cousins, 1985; Hamer, 1986; Kägi & Kojima, 1987; Klaassen, 1999).

En base a sus aspectos estructurales, las MTs se han dividido en diversas familias (Binz & Kägi, 1999). Las MTs de mamífero pertenecen a la familia 1, que comprende varias subfamilias, m1-m4. En el ratón las subfamilias m1-4 están compuestas por un solo miembro (MT-I en la subfamilia m1, MT-II en la m2, etc.), mientras que en ungulados y primates existe un claro polimorfismo genético. En humanos los genes MT están localizados en el cromosoma 16, y conforman una familia de al menos 12 genes, algunos de los cuales no son funcionales (Hamer, 1986; West et al., 1990; Samson & Gedamu, 1998). En posición 5’ se encuentra el gen MT-4, que se expresa fundamentalmente en el epitelio estratificado queratinizado (Quaife et al., 1994), a continuación el gen MT-3, que se expresa principalmente en el SNC, y luego el gen MT-2 y cinco genes funcionales MT-1 designados MT-1A-MT-1G que se expresan de forma general (Samson & Gedamu, 1998). En el ratón los genes MT residen en el cromosoma 8 (Palmiter et al., 1992; Palmiter et al., 1993b; Quaife et al., 1994) y siguen un patrón de expresión similar a los humanos (Searle et al., 1984; Yagle & Palmiter, 1985; Palmiter et al., 1992; Kobayashi et al., 1993; Quaife et al., 1994).

Presumiblemente las funciones biológicas de las MT pueden correlacionarse con sus propiedades químicas y estructurales. Las tres isoformas que se expresan en el SNC, MT-I, MT-II y MT-III, están compuestas de una única cadena polipeptídica de 61-68 amino ácidos, 20 de los cuales son residuos Cys, y, notablemente, carecen de aminoácidos aromáticos o de Histidina (His). Sus secuencias se caracterizan por la presencia de varias repeticiones Cys-X-Cys y Cys-Cys y por la alta conservación de las Cys entre las diferentes MTs (Kägi & Schäffer, 1988). Estas proteínas pueden unir 7 metales divalentes (Zn(II), Cd(II)) y hasta 12 monovalentes (Cu(I)) mediante enlaces con los grupos tiol de las Cys (Vasák & Kägi, 1994). Los metales se distribuyen en dos grupos que contienen 3 y 4 metales divalentes o 6 metales monovalentes cada uno, localizados en dominios independientes de la proteína designados a (residuos 32-61) y ß (residuos 1-31) (Vasák & Kägi, 1994). La secuencia de la MT-III, en comparación a las de las MT-I&II, muestra dos insertos, un residuo Treonina (Thr) en la región N-terminal y un hexapéptido en la región C-terminal, y una secuencia Cys(6)-Pro-Cys-Pro(9) que le es propia (Uchida et al., 1991).

Metalotioneínas en el Sistema Nervioso Central:

Factores neuroprotectores

El consenso general es que las MT-I&II se expresan por todo el SNC, siendo los astrocitos la principal fuente de estas proteínas (Young et al., 1991; Blaauwgeers et al., 1993; Young, 1994; Nakajima & Suzuki, 1995; Penkowa & Moos, 1995; Vela et al., 1997; Acarin et al., 1999b; Carrasco et al., 1999). Las neuronas expresan estas proteínas en menor medida (Blaauwgeers et al., 1993; Masters et al., 1994; Kiningham et al., 1995; van Lookeren Campagne et al., 1999), mientras que en condiciones normales la microglía y los oligodendrocitos no parecen expresarlas. Sin embargo, células microgliales activadas por diversos tipos de estímulos muestran una clara expresión de MT-I&II (Vela et al., 1997; Acarin et al., 1999b; Carrasco et al., 1999; Penkowa et al., 1999a; Penkowa et al., 1999c; Carrasco et al., 2000b).

A diferencia de las MT-I&II, la MT-III es una isoforma que se expresa fundamentalmente en el SNC, y fue denominada originalmente “Growth Inhibitory Factor (GIF)” (Uchida et al., 1991), si bien actualmente no hay dudas de que es un miembro de la familia de las MT (Palmiter et al., 1992). Respecto a su localización celular, al día de hoy existen fuertes discrepancias en la literatura en función del sistema de detección usado. Cuando se identifica la proteína, la expresión de la MT-III está localizada fundamentalmente en astrocitos (Uchida et al., 1991; Hozumi et al., 1996; Yamada et al., 1996; Acarin et al., 1999a; Carrasco et al., 1999; Penkowa et al., 1999c; Carrasco et al., 2000a; Penkowa et al., 2001), mientras que si analizamos su RNA mensajero la localización es básicamente neuronal (Masters et al., 1994b; Anezaki et al., 1995; Yuguchi et al., 1995a; Carrasco et al., 1998a; Acarin et al., 1999a; Penkowa et al., 1999b; Velázquez et al., 1999), aunque las discrepancias entre autores son obvias (Kobayashi et al., 1993; Uchida, 1993; Yanagitani et al., 1999).

Las lesiones traumáticas del SNC inician una compleja secuencia de respuestas patofisiológicas en el lugar de la lesión. En fases tempranas la destrucción de los vasos sanguíneos causa una extravasación de sangre en la zona lesionada, llenándola de células que inician una respuesta inflamatoria característica. La pérdida de riego sanguíneo causa isquemia e hipoxia local, lo que junto a una gran liberación de aminoácidos excitatorios provoca la necrosis de neuronas y células gliales locales y la degeneración de fibras nerviosas que atraviesan la zona dañada. Posteriormente a estas respuestas tempranas, la microglía residente y los monocitos/macrófagos infiltrantes se activan y transforman en macrófagos cerebrales ameboides, los linfocitos infiltran masivamente el área dañada, y células endoteliales locales migran y proliferan. Los astrocitos se activan también en respuesta al daño del SNC. El reclutamiento y activación de todas estas células limita la degeneración neuronal y la extensión de la lesión, resultando finalmente en una cicatriz glial rodeando la zona lesionada. Generalmente se acepta que esta respuesta inflamatoria está orquestada por la secreción de citoquinas, quimioquinas y otros factores por parte, fundamentalmente, de los astrocitos, macrófagos cerebrales y otras células inflamatorias, que estimulan a neuronas y células gliales para que produzcan sus propias citoquinas, factores de crecimiento y neurotrofinas (para revisiones consúltese Giulian et al., 1989; Eddleston & Mucke, 1993; Mattson & Scheff, 1994; Hopkins & Rothwell, 1995; Perry et al., 1995; Rothwell & Hopkins, 1995; Merrill & Benveniste, 1996; Ridet et al., 1997; McIntosh et al., 1998; Muñoz-Fernández & Fresno, 1998; Stichel & Verner Müller, 1998; Hughes et al., 1999; Horner & Gage, 2000; Allan & Rothwell, 2001; Aloisi, 2001; Dong & Benveniste, 2001).

La evidencia experimental que apoya un papel significativo del estrés oxidativo en el cerebro tras una lesión traumática es abrumadora. El cerebro es especialmente susceptible a sufrir daño por la generación de radicales del oxígeno porque sus membranas son ricas en ácidos grasos poliinsaturados, produce cantidades importantes de óxido nítrico, tiene una pobre actividad catalasa y sólo moderada superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa (enzimas antioxidantes que forman una potente línea de defensa contra el estrés oxidativo), y es rico en hierro, el cual puede ser liberado desde las células moribundas y generar el altamente reactivo radical hidroxilo mediante la reacción de Fenton. Una lesión del SNC causa una entrada y activación de células inflamatorias, las cuales típicamente incrementan la formación de radicales libres como mecanismo de neutralización de patógenos que eventualmente penetran en la zona lesionada, pero también como consecuencia de su actividad fagocítica de los restos tisulares. En esta situación, y más aún cuando la perfusión sanguínea del tejido se reestablece, se da un desequilibrio entre los sistemas antioxidantes y la formación de radicales libres, y, por tanto, estrés oxidativo. Evolutivamente los organismos han desarrollado mecanismos de protección contra el estrés oxidativo que incluyen los enzimas antioxidants descritos antes, secuestrantes de radicales libres como el glutatión, vitamina E y los ß-carotenos, así como proteínas que unen metales de transición como el hierro y el cobre (para revisiones consúltese (Halliwell, 1992; Coyle & Puttfarcken, 1993; Olanow, 1993; Mattson & Scheff, 1994; Merrill & Benveniste, 1996; Heales et al., 1999; Lipton, 1999; Pentreath & Slamon, 2000)).

Mi laboratorio junto con otros ha demostrado que la familia de las MT son factores neuroprotectores significativos frente al daño oxidativo. Mt1&2 se expresan de forma coordinada en la mayoría de tejidos incluido el SNC, y se inducen por estímulos inflamatorios, estrés y metales pesados (Yagle & Palmiter, 1985; van Lookeren Campagne et al., 2000). En humanos sabemos que las MT-I&II están inducidas en enfermedades neurodegenerativas tan importantes como la enfermedad de Alzheimer (Duguid et al., 1989; Adlard et al., 1998), la esclerosis lateral amiotrófica (Sillevis Smitt et al., 1992) y la esclerosis múltiple (Lock et al., 2002). En modelos animales sabemos que las MT-I&II se inducen por daño cerebral inducido por estrés (Hidalgo et al., 1990), criolesión (Penkowa & Moos, 1995; Penkowa et al., 1999a), convulsiones epilépticas (Dalton et al., 1995; Zheng et al., 1995; Montpied et al., 1998; Carrasco et al., 2000b), NMDA (Acarin et al., 1999b), 6-aminonicotinamida (Penkowa et al., 1997; Penkowa et al., 1999b), isquemia (Neal et al., 1996; van Lookeren Campagne et al., 1999; van Lookeren Campagne et al., 2000) y expresión transgénica de citoquinas proinflammatorias (Hernández et al., 1997; Carrasco et al., 2000a; Giralt et al., 2001). La producción de ratones genéticamente alterados (Michalska & Choo, 1993; Palmiter et al., 1993a; Masters et al., 1994a) es una herramienta poderosa que ha ayudado de forma importante en el conocimiento de los posibles roles de estas proteínas. Así, la sobreexpresión de MT-I protege contra la isquemia cerebral focal (van Lookeren Campagne et al., 1999), mientras que ratones con ausencia de MT-I&II (comúnmente conocidos como ratones MT-I&II KO, “knock-out”) son más susceptibles (Trendelenburg et al., 2002). Igualmente, los ratones MT-I&II KO muestran una respuesta muy deficiente a lesiones traumáticas del SNC, con una respuesta inflamatoria alterada, un estrés oxidativo y muerte celular por apoptosis (un mecanismo celular intrínseco que permite a la célula suicidarse sin afectar a sus vecinas) incrementados, y una reparación tisular disminuida (Penkowa et al., 1999a; Penkowa et al., 2000; Penkowa et al., 2001). Estos efectos se revierten en ratones con sobreexpresión de MT-I e, interesantemente, por la inyección de MT-II (Giralt et al., 2002b). Lo último abre perspectivas terapéuticas prometedoras que, además, se ven reforzadas por el hecho de que tratamientos similares han demostrado su eficacia en modelos experimentales de esclerosis múltiple (Penkowa & Hidalgo, 2000; 2001; 2003). El efecto neuroprotector de estas proteínas es también obvio en modelos de daño del SNC inducido por citoquinas (Giralt et al., 2002a; Molinero et al., 2003) o por gliotoxinas (Penkowa et al., 2002). Estos y otros resultados apoyan la idea de que las MT-I&II son potentes factores antioxidantes, particularmente efectivos en el SNC.

La función de la MT-III, que se expresa preferentemente en neuronas, es menos clara. Su expresión se ve afectada en respuesta al daño del SNC, incluyendo lesiones traumáticas, excitotoxicidad, secciones de nervios, o isquemia (Anezaki et al., 1995; Hozumi et al., 1995; Yuguchi et al., 1995a; Yuguchi et al., 1995b; Hozumi et al., 1996; Inuzuka et al., 1996; Yamada et al., 1996; Acarin et al., 1999a; Penkowa et al., 2000), pero su relevancia fisiológica no está clara ya que los ratones MT-III KO no difieren significativamente de los controles en sus respuestas a lesiones traumáticas (Carrasco et al., 2003).

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Agradecimientos

Querría agradecer la ayuda de Milena Penkowa y de los estudiantes y colegas de mi laboratorio, sin los cuales nada habría sido posible. Gracias también a los diversos investigadores con los que he tenido el privilegio y el placer de colaborar, espero que sigáis contando conmigo.

Sitios WWW de interés

- http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html

- http://www.metallothionein.com