BIOLOGIA	Análisis de células vegetales expuestas a microgravedad
Acroread	© Gary Chinga, 2003  Gary.Chinga@pfi.no

RESUMEN[ABSTRACT]

Protoplastos de la raíz de Brassica napus, expuestos a microgravedad, fueron reconstruidos y analizados. Basados en la reconstrucción tridimensional, fue posible visualizar los tres mayores orgánulos en las células analizadas, es decir, el núcleo, la vacuola y los amiloplatos. Los amiloplatos fueron encontrados agrupados alrededor del núcleo en todos los casos. Se presume que esta redistribución se debe a la preparación de los protoplastos al eliminar la pared celular.

Las plantas siempre están expuestas a estímulos externos como el contacto (thignotropismo), luz (fototropismo) y gravedad (gravitropismo). Un estímulo como la gravedad puede determinar la dirección en la cual los órganos se orientan. Este tipo de movimiento es conocido como gravitropismo. Éste puede ser positivo, como es el caso de las raíces, las cuales crecen en la dirección de la gravedad, o negativo, como en los tallos.

Un punto de gran interés en la investigación acerca del gravitropismo es la reacción de diferentes células y orgánulos al estímulo de la gravedad. Una de las partes de las plantas que crea mayor interés es la raíz. Ésta puede ser dividida en cuatro sectores principales; la zona de los pelos de la raíz, la zona de elongación, el punto de crecimiento y la cofia de la raíz. En el punto de crecimiento se encuentran células que se presumen son las responsables de la percepción de la gravedad; éstas se denominan estatocitos (eng. statocytes). Estudios previos de estatocitos en plantas como la A. thaliana, han demostrado una polaridad de los principales orgánulos en la célula; el núcleo localizado en la parte proximal, los amiloplatos en la parte distal y los otros orgánulos distribuidos en la parte central (Olsen et al., 1984; Chinga et al., 2000). Una organización similar ha sido demostrada en otras células vegetales (Moore, 1985; Moore, 1986). El efecto de la gravedad en la distribución de orgánulos en células vegetales puede ser estudiado en tierra, con aparatos que simulan la microgravedad como los clinostatos o en el espacio, en viajes espaciales.

Los protoplastos, células vegetales sin su pared celular, han sido ampliamente usados para investigar aspectos como la regeneración de la pared celular, división, crecimiento y diferenciación celular (Iversen et al., 1992; Rasmussen et al., 1992). Este tipo de sistema modelo es conveniente para analizar los procesos de regeneración cuando las células son expuestas a microgravedad?(micro-g) (Rasmussen et al., 1992). Rasmussen et al. (1994a) encontró una relación entre la influencia de micro-g y la retardación de la regeneración de la pared celular. Aparentemente esto lleva a la formación de agregados celulares de menor tamaño. Aunque los protoplastos han sido privados de su pared celular, los protoplastos expuestos a 1g tienen un cierto contacto intercelular, el cual ciertamente está ausente en condiciones de micro-g debido a la distribución al azar de las células. Este contacto intercelular podría ser la causa de una diferencia en el tamaño de los agregados expuestos a micro-g y 1g. Una mayor cantidad de intercambio de nutrientes entre células en contacto, como es el caso de las células expuestas a 1g, podría fomentar el crecimiento en este grupo. Como una tentativa para eliminar esta diferencia en el tratamiento de células expuestas a micro-g y 1g, Iversen et al. (1996) usó protoplastos inmovilizados en alginat en el experimento SMM/03 “PROTO” llevado a cabo en el transbordador Atlantis, en 1996.

Aunque la regeneración de las células vegetales ha sido ampliamente estudiada tanto en condiciones de micro-g como 1g, nueva información acerca de la distribución de los orgánulos vegetales puede ser obtenida aplicando técnicas como la reconstrucción tridimensional (Chinga et al., 2000). En este estudio, técnicas de microscopía y procesamiento de imágenes digitales han sido aplicadas al estudio de células vegetales expuestas a micro-g y 1g tanto en el espacio como en experimentos de control llevados a cabo en Cabo Cañaveral en 1996. Varias reconstrucciones son presentadas.

Materiales y métodos

Cuatro diferentes tipos de protoplastos fueron reconstruidos. Cada tipo de célula fue expuesta a una condición diferente, variando la gravedad desde micro-g hasta 1,4g (Tabla 1). Los protoplastos expuestos a micro-g fueron parte del experimento SMM/03 “PROTO” llevado a cabo en el transbordador Atlantis en 1996 (Para más detalles vea Iversen et al., 1996)

Tabla 1 Resumen de los protoplastos usados en este estudio, SMM/03 “Proto”. fc: “flight control” (en vuelo), gc: “ground control” (en tierra). El material fue expuesto 48 horas a su respectivo tratamiento.

Los protoplastos de Brassica napus fueron aislados usando el método descrito por Power & Cocking (1970). Éste consiste en tratar el material vegetal con enzimas como pectinasas y celulasas. La función principal de las pectinasas es disolver la lámina media - compuesta mayormente por pectina-, mientras las celulasas disuelven la pared celular liberando el protoplasto. Los protoplastos fueron posteriormente inmovilizados en alginat (Draget et al., 1988). Una vez expuestos a sus respectivos tratamientos los protoplastos fueron embutidos en LX112 y LR White. Para más detalles vea Chinga (1997).

Para la reconstrucción tridimensional, los protoplastos fueron divididos en segmentos a través de técnicas de microtomía, teniendo cada segmento un espesor de 0.5 micrometro. Imágenes digitales de cada segmento fueron consecutivamente adquiridas usando una cámara CCD (Sony) montada en un microscopio Zeiss. Las imágenes fueron posteriormente procesadas y analizadas en el programa NIH Image. Una serie de rutinas fueron escritas para procesar las imágenes y hacer las reconstrucciones tridimensionales. “Volume rendering” fue llevado a cabo usando el VolumeJ plugin (Abràmoff & Viergever, 2002). Este plugin y otras rutinas relevantes para este tipo de trabajo, así como el programa principal, pueden ser encontradas y bajadas gratuitamente de la página de ImageJ. El volumen de las células y orgánulos fue calculado de acuerdo a la siguiente fórmula (Coombs et al., 1986):

        (1)

donde A representa el area de la célula/orgánulo en el respectivo segmento (i) y z representa el espesor de los segmentos. Para más detalles vea Chinga (1997).

Resultados

A pesar de las dificultades de obtener imágenes digitales apropiadas para hacer las reconstrucciones, el material obtenido dio la base para llevar a cabo el estudio cualitativo y cuantitativo.

Figura 1. A) Reconstrucción tridimensional de protoplastos de Brassica napus. B) Orgánulos visualizados en un protoplasto tales como la vacuola (V), el núcleo (N) y algunos amiloplatos (Am). Raya 10 µm.

Una vez reconstruidas, las células pueden ser visualizadas desde diferentes posiciones (Fig. 1A y 2A). La rotación de estos modelos facilita el estudio de la distribución de los orgánulos. Uno de los segmentos usados para esta reconstrucción es también presentado en la Fig. 1B.

Figura 2. A) “Volume rendering” del protoplasto reconstruido. Un segmento ha sido removido para visualizar el interior de la célula. B) Reconstrucción tridimensional de los orgánulos dentro de un protoplasto. La mayor parte de la célula esta ocupada por la vacuola (amarilla), mientras que el núcleo (café) y los amiloplatos (rojos) están situados en la parte superior. Raya: 10 µm.

Otra alternativa para visualizar los protoplastos es “volume rendering” (Fig. 2). Estas reconstrucciones pueden también ser segmentadas para visualizar los orgánulos por separados y su distribución (Fig. 3).

Aunque no fue encontrada ninguna diferencia en la distribución de los orgánulos en las cuatro tipos de células analizadas, el tamaño de las células es considerablemente diferente. Los protoplastos expuestos a micro-g muestran un tamaño mayor al mostrado por los protoplastos usados como control en tierra (Fig. 4 y Tabla 2).

La Tabla 2 muestra una considerable diferencia en la cantidad de amiloplatos y volumen celular en las dos reconstrucciones usadas. Los protoplastos expuestos a micro-g muestran una clara tendencia de poseer un mayor tamaño que los usados como control. Rasmussen et al. (1994b) menciona que los protoplastos expuestos a micro-g son mayores que los expuestos a 1g debido a la falta de la pared celular. Larsen (1993) también demostró el mayor tamaño de las células expuestas a micro-g.

Figura 3. Reconstrucción tridimensional de los orgánulos de protoplastos de Brassica napus. “Volume rendering”. Reconstrucción por separado del núcleo (A), los amiloplatos (B) y la vacuola (C). Raya 10 µm.

Células vegetales expuestas a micro-g también han mostrado una clara reorganización de sus orgánulos. Los amiloplatos se redistribuyen y localizan mayormente en la parte proximal de la célula (Olsen et al., 1984; Chinga et al., 2000). En el caso específico de los protoplastos, pareciera que los orgánulos se reagrupan alrededor del núcleo. Se asume que el núcleo está apegado a la membrana celular, rodeado por microfilamentos (Lorenzi & Perbal, 1990) y que los microfilamentos actúan sobre los estatolitos (eng. statolith) estabilizando sus posiciones (Heinowicz & Sievers, 1981; Bartnik & Sievers, 1988). Esta podría ser la causa de la clara redistribución de los orgánulos alrededor del núcleo y que ha sido evidenciada en este estudio.

Figura 4. Volumen celular de los 4 protoplastos analizados.

Este estudio es uno de varios experimentos llevados a cabo en el espacio. La razón principal de estos estudios es el interés de la Agencia Espacial Europea de llevar a cabo experimentos científicos de plantas en la Estación Espacial Internacional. El motivo es estudiar la reacción de las plantas, en relación al desarrollo y crecimiento, cuando son privadas de la fuerza de la gravedad. Para mayor información sobre las actividades del grupo de investigación espacial de la NTNU contactarse con el autor (Gary.Chinga@chemeng.ntnu.no) o con el Profesor Tor-Henning Iversen (Tor-Henning.Iversen@chembio.ntnu.no), Plantebiosenteret, NTNU.

Tabla 2 Estudio morfológico de los protoplastos expuestos a micro-g y 1g.

Agradecimientos

Me gustaría agradecer la ayuda dada por el resto del grupo, encabezada por el Profesor Tor-Henning Iversen, que viajó desde Noruega y realizó los experimentos en Kennedy Space Center, Florida, en marzo de 1996. La ayuda de los colegas del Plantebiosenteret, NTNU es también apreciada.

Referencias

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